КЛИНИЧЕСКАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ 1/2013

Годовалова О. С., Савельев С. В., 2013

УДК 611.81-053.001.42

НЕЙРОНАЛЬНАЯ МИГРАЦИЯ ПОД БОРОЗДАМИ И ИЗВИЛИНАМИ НЕОКОРТЕКСА В ФЕТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА

О.С. Годовалова, С.В. Савельев
ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, Москва

При иммуногистохимическом исследовании распределения глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), нейронального белка β-III-тубулина и фактора нейрональной миграции рилина на соседних серийных срезах была обнаружена гетерогенность рилинзависимых тангенциальных миграций β-IIIтубулин-иммунопозитивных нейробластов под бороздами и извилинами в перивентрикулярной области с 14-й по 26-ю неделю пренатального развития. Тангенциальные миграции в большей степени выражены под первичными и вторичными бороздами, чем под прямыми участками коры.

NEURONAL MIGRATION UNDER SULCI AND GYRI OF THE NEOCORTEX IN THE HUMAN FETUSES

O.S. Godovalova, S.V. Saveliev

Neuronal migration was investigated immunohistochemically using antybodies to glial fi brillary acidic protein (GFAP), neuronal protein β-III-tubulin, and neuronal migration factor reelin. On adjacent serial sections of the periventricular region in 14-26-week old fetuses, we found heterogeneity in the pattern of reelin-dependent tangential migration of β-III-tubulin immunopositive neuroblasts under sulci and gyri. Tangential migration was more pronounced under the primary and secondary furrows than under smooth portions of the cortex.

В полушариях головного мозга млекопитающих известны радиальные и тангенциальные миграции. Выделяют два типа радиальной миграции – транслокацию и локомоцию. Путем транслокации передвигаются первые мигрирующие в кору клетки, причем как нейробласты, так и клетки радиальной глии [4]. После формирования радиальных глиальных направляющих для нейробласта становится характерна локомоция вдоль волокна радиальной глии, или глиофильная миграция [4, 9]. Будущие нейроны, выходя из вентрикулярной зоны, вытягиваются вдоль глиального волокна и начинают двигаться в сторону коры вдоль волокна радиальной глии, сохраняя связь с ним на всем протяжении [9]. Известно, что под бороздами глиальные волокна короче, чем под извилинами [10], но неясно, влияет ли это на темпы миграции нейробластов в неокортексе внутри борозд. Существуют ли в этих областях свои механизмы координации нейрональных миграций? Исходя из этого, целью данной работы стало изучение особенностей миграции нейробластов под бороздами и извилинами.

Материалы и методы

В работе использовался аутопсийный материал головного мозга плодов человека от 14-й до 34-й недели (20 случаев). Проводилось гистологическое окрашивание фронтальных срезов полушария методом Ниссля, иммуногистохимическое маркирование глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), нейронального белка β-III-тубулина и фактора нейрональной миграции рилина на соседних серийных срезах.

Результаты

В 14 недель β-III-тубулин-иммунореактивность выявляется в нервных отростках и телах нейронов и нейробластов по всей толщине стенки полушария. Особо отметим вентрикулярную зону, где маркер присутствует, волокна радиальной глии также маркированы. С 16-й недели наблюдается ослабление β-III-тубулиниммунореактивности вентрикулярной области, практически полностью исчезает маркирование радиальной глии. В 16 недель β-III-тубулин-иммунореактивность выявляется в большей степени в субвентрикулярной зоне, чем в вентрикулярной. В вентрикулярной зоне отмечаются редкие β-III-тубулин-позитивные клетки с широкой окрашенной каймой цитоплазмы вокруг плотного ядра и густо окрашенными отростками (рис. 1 А). Отметим, что в перивентрикулярной области под бороздами встречается много β-III-тубулин-позитивных клеток, тела которых тангенциально вытянуты (рис. 1 Б). β-III-тубулин выявляется также в обильной сети нервных волокон интермедиальной, корковой и краевой зон; умеренное маркирование отмечено в телах всех нейробластов и нейронов корковой и краевой зон. В средней части корковой пластинки после 16,5 недели выявляются редкие β-III-тубулин-иммунопозитивные клетки пирамидной и звездчатой формы. Подобный характер распределения β-III-тубулин-иммунореактивности сохраняется до 23-й недели. После 23-й недели в вентрикулярной зоне перестают выявляться мультиполярные β-III-тубулин-иммунопозитивные нейроны с длинными отростками. Для этой зоны становятся характерны β-IIIтубулин-позитивные клетки с короткими отростками. КЭМ-5. 
Маркер GFAP на стадии 14 недель не выявляется. С 16-й недели GFAP обнаруживается в вентрикулярной зоне стенки полушария и радиально отходящих из нее волокнах. С 16,5 по 23-ю неделю GFAP-позитивные клетки присутствуют в вентрикулярной и субвентрикулярной зонах стенки полушария. Также обнаруживаются радиально направленные волокна в интермедиальной зоне. С 24-й недели пренатального развития, или после стадии сглаженной шпорной борозды, в интермедиальной зоне начинают выявляться единичные GFAP-иммунопозитивные астроциты, а с 26-й недели GFAP-иммунопозитивные астроциты обнаруживаются также в краевой зоне (рис. 1 В).
Рилин-иммунореактивность в 14–34 недель пренатального развития выявляется в клетках краевого слоя неокортекса шпорной, теменно-затылочной борозд и прямых участков коры. Окрашен также окружающий эти клетки матрикс краевой зоны. С возрастом наблюдается ослабление маркирования этих клеток, что указывает на ослабление экспрессии фактора радиальной миграции рилина. В период с 16-й по 26-ю неделю на границе субвентрикулярной и интермедиальной зон выявляются клетки и волокна, в цитоплазме которых содержатся рилин-позитивные гранулы (рис. 1 Г). Часто хорошо прослеживается тангенциальная ориентация этих волокон. Интенсивность рилин-иммунореактивности таких волокон, как правило, связана с глубиной борозды, под которой они наблюдаются. Чем глубже борозда, тем интенсивнее иммуногистохимическая реакция на рилинподобных волокнах.




Рис. 1.
А – β-III-тубулин-иммунопозитивные клетки с отростками в вентрикулярной зоне (ВЗ), 16,5 недели; Б – β-III-тубулин-иммунопозитивные тангенциально вытянутые тела нейробластов в перивентрикулярной области под шпорной бороздой, 19 недель;
В – GFAP-иммунопозитивные астроциты в интермедиальной зоне, 26 недель;
Г – рилин-иммунопозитивные гранулы на границе субвентрикулярной (СВЗ) и интермедиальной (ИЗ) зон, 19 недель; линейка 20 мкм


Обсуждение

Согласно полученным данным, с 16-й недели выявляется GFAP-иммунопозитивная радиальная глия. Вдоль нее происходят миграции вытянутых биполярных нейробластов, цитоплазма которых иммунопозитивна к β-III-тубулину. На более ранних стадиях радиальные волокна GFAP-иммунонегативны, хотя на гистологических препаратах этой стадии хорошо различимы радиальные отростки клеток, тела которых располагаются в вентрикулярной зоне, а отростки заканчиваются в краевой зоне. Согласно данным N. Zecevic [12], экспрессия GFAP клетками радиальной глии выявляется с 5,5-й недели (клон 6F2), а B.H. Choi, L.W. Lapham [3] обнаруживали GFAP-экспрессию с 10-й недели (клон не указан).
Мы полагаем, что начало экспрессии отдельных изоформ белка может различаться. В своей работе мы использовали моноклональные антитела, клон GA-5. Появление данной изоформы белка с 16-й недели может быть связано с некими морфогенетическими событиями в стенке полушария. После 23-й недели характерно появление GFAP-иммунопозитивных астроцитов, что свидетельствует об ослаблении радиальной миграции, дифференцировке радиальной глии в астроциты.
С помощью иммуногистохимической реакции на рилин на границе субвентрикулярной и интермедиальной зон было выявлено достаточное количество тангенциально направленных рилин-иммунопозитивных волокон и тел клеток (рис. 1 Г). В этой же области наблюдаются тангенциально вытянутые тела клеток, хорошо различимые на гистологических препаратах. С помощью иммуногистохимической реакции на β-IIIтубулин было показано, что большинство этих клеток является нейробластами (рис. 1 Б). Недавние исследования на мутантных мышах reeler также подтверждают рилинзависимую тангенциальную миграцию нейробластов из вентрикулярной зоны [2]. Согласно нашему исследованию, существуют принципиальные различия в характере миграции под бороздами и под прямыми участками коры. В области дна борозд для вентрикулярной/субвентрикулярной зон характерно уменьшение их ширины. Наблюдается большее количество тангенциально вытянутых тел клеток в субвентрикулярной зоне под бороздами. Уровень рилиниммунореактивности на границе интермедиальной и субвентрикулярной зон под бороздами выше, чем под прямыми участками неокортекса.
Кроме нейробластов в вентрикулярной и субвентрикулярной зонах мы выявили β-III-тубулин-позитивные мультиполярные клетки с плотным ядром и обширной цитоплазмой на фоне бесцветных или слабо окрашенных клеток-предшественников. Морфология ядра и β-III-тубулин-позитивной цитоплазмы характеризует эти клетки как вышедшие из пролиферации нейроны. Возможно, это мигрирующие нейроны, которые пускают в разные стороны свои длинные отростки в поисках сигнала о дальнейшем пути следования. Отметим, что выявляются также очень редкие, подобные описанным выше клеткам радиально расположенные β-IIIтубулин-позитивные клетки в субвентрикулярной зоне, но не в интермедиальной. Известно, что основные тангенциальные пути расположены в интермедиальной, субвентрикулярной и краевой зонах. Из интермедиальной зоны часть интернейронов может в определенный момент радиально направиться в вышележащую кору головного мозга. Другая часть интернейронов, прежде чем достичь своего конечного положения в коре, мигрирует к вентрикулярной области, где, вероятно, клетки получают информацию о своей будущей позиции в коре. Далее они радиально, мигрируя вдоль глиального волокна, достигают коры. Подобные нисходящие миграции интернейронов встречаются также из краевой зоны [5, 8]. В работе на крысах показано, что большинство нейробластов (82%), произошедших из вентрикулярной зоны, быстро принимает биполярную форму и мигрирует в субвентрикулярную зону. Далее они становятся мультиполярными и примерно на сутки прекращают какую-либо миграцию. Потом 59% мультиполярных нейронов совершает ретроградное движение в вентрикулярный слой, откуда они будут мигрировать вдоль глиального волокна. Для нейробластов из субвентрикулярной популяции, рожденных симметричным делением, в 70% случаев также характерно ретроградное движение в вентрикулярную область [8]. В ряде других исследований аналогично показано наличие мультиполярных нейронов на границе субвентрикулярной и интермедиальной зон. Вероятно, эти нейроны стоят на развилке, ожидая неких сигналов, чтобы начать тангенциальную или радиальную миграцию [7, 11].
В нашем исследовании в интермедиальной зоне, где радиально мигрируют множественные нейробласты, не удается идентифицировать более интенсивно окрашенные и морфологически зрелые нейроны. Такие редкие радиально направленные нейроны выявляются лишь в субвентрикулярной и корковой зонах. Не исключено, что это может указывать на быстрые темпы миграции в интермедиальной области по сравнению с долгим периодом пребывания этих нейронов на границе с субвентрикулярной областью.
С другой стороны, эти клетки могут координировать пути миграции нейробластов. Для этого они образуют своими отростками густую сеть в пределах вентрикулярной зоны уже с 16,5 недели (рис. 1 А). Последние исследования выявляют электрическую активность в субвентрикулярной зоне человека уже с 16-й недели гестации [6]. Согласно ранее полученным данным [1], ГАМК-ергическая синаптическая активность в вентрикулярной зоне регистрируется только с 26-й недели внутриутробного развития. Возможно, эти клетки регулируют миграцию посредством другого медиатора – глутамата или ацетилхолина, поскольку известна доминирующая роль возбуждающей синаптической активности на ранних этапах развития головного мозга, либо взаимодействия этих мультиполярных клеток с клетками-мишеням не имеют синаптического характера.

Выводы

Обнаружена гетерогенность рилинзависимых тангенциальных миграций β-III-тубулин-иммунопозитивных нейробластов под бороздами и извилинами в перивентрикулярной области с 14-й по 26-ю неделю пренатального развития. Тангенциальные миграции в большей степени выражены под первичными и вторичными бороздами, чем под прямыми участками коры.
С 16,5 по 23-ю неделю в вентрикулярной зоне обнаружены β-III-тубулин-иммунопозитивные мультиполярные нейроны с плотным ядром и широкой цитоплазмой, функциональная роль которых спорна. Полагаем, что они существуют для координации миграции нейробластов.
Для сроков после 23-й недели характерно появление GFAP-иммунопозитивных астроцитов, что свидетельствует об ослаблении радиальной миграции нейро блас тов, дифференцировке радиальной глии в астроциты.

Литература

1. Годовалова О. С., Савельев С. В. Экспрессия ГАМК транспортера (GAT-1) и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в созревающем неокортексе человека // Российский медико-биологический вестник им. И.П. Павлова. 2012. № 2. С. 132–137.
2. Britanova O. Alifragis P., Junek S., Jones K., Gruss P., Tarabykin V. A novel mode of tangential migration of cortical projection neurons // Developmental Biology. 2006. V. 298. N. 1. P. 299–311.
3. Choi B. H., Lapham L. W. Radial glia in the human fetal cerebrum: a combined Golgi, immunofl uorescent and electron microscopic study // Brain Res. 1978. V. 148. P. 295–311.
4. Hatanaka Y., Hisanaga S., Heizmann C. W., Murakami F. Distinct migratory behavior of earlyand late-born neurons derived from the cortical ventricular zone // J. Comp. Neur. 2004. V. 479. N. 1. P. 1–14.
5. Kriegstein A. R., Noctor S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex // TRENDS in Neurosciences. 2004. V. 27. N. 7. Р. 392–9.
6. Moore A. R., Filipovic R., Mo Z., Rasband M. N., Zecevic N., Antic S. D. Electrical Excitability of Early Neurons in the Human Cerebral Cortex during the Second Trimester of Gestation // Cerebral Cortex. 2009. V. 19. P. 1795–1805.
7. Nadarajah B., Alifragis P., Wong R. O.L., Parnavelas J. G. Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex: Observations Based on Real-time Imaging // Cerebral Cortex. 2003. V. 13. N. 6. Р. 607–11.
8. Noctor S. C., Martinez-Cerdeno V., Ivic L., Kriegstein A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specifi c phases // Nat. Neurosci. 2004. V. 7. P. 136–44.
9. Rakic P. Mode of cell migration to the superfi cial layers of fetal monkey neocortex // J. Comp. Neur. 1972. V. 145. P. 61–84.
10. Smart H. M., Mcsherry G. M. Gyrus formation in the cerebral cortexs in the ferret // J. Anat. 1986. V. 146. P. 141–52.
11. Tabata H., Nakajima K. Multipolar Migration: The Third Mode of Radial Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex // The Journal of Neuroscience. 2003. V. 23. N. 31. Р. 9996–10001.
12. Zecevic N. Specifi c Characteristic of Radial Glia in the Human Fetal Telencephalon // Glia. 2004. V. 48 P. 27–35.